ELISA样本制备SOP

(一)制备前准备工作

1.仪器：

超声破碎仪；分析天平（AL204型）；离心机

2.试剂：

1×PBS缓冲液pH7.2；PMSF；

3.其它：

1 L烧杯、超纯水

（二）常规样本

    1.细胞培养上清：300 × g 离心 10 分钟去除沉淀物，即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

2. 血清样本：离心管收集血清。血样凝集 30 分钟后，1,000 × g 离心 10 分钟。吸取血清样本之后即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

3.血浆样本：EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1,000 × g 离心 30 分钟收集样本。即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存。

注意：检测前，样本中可见的沉淀必须去除。不要使用严重溶血或高血脂的样本。样本应分装并贮存于-20℃，以避免活性丢失。如果在 24 小时内检测。样本可以存放在 2 - 8℃。避免样本的反复冻融。在检测前，冷冻样本应缓慢地恢复至室温，轻柔地混匀。

（二）组织样本制备过程

1. 在分析天平（AL204型）上，称量50 ~100m g组织样本。

2. 在样本中加入5倍质量体积的含1% PMSF的1X PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。

注：1X PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1 mM。

3. 打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2 s，间隔时间5 s，总时间2 min。放入样本，冰上超声3 min。视样本匀浆情况调整总时长。

4. 超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30 min。

5. 打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10 min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。

注：留取20 μl样本，用于后续BCA测定。

（三）细胞样本制备过程

1.对于贴壁细胞：去除培养液，用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100 μl的含1% PMSF的1X PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30 min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。

2.对于悬浮细胞：离心收集细胞，以2百万细胞为例，在样本中加入100 μl的含1% PMSF的1X PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30 min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成 （5-10）×10 ⁵ 细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。

注：1X PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1 mM。

 3. 打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10 min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。

注：留取20 μl样本，用于后续BCA测定。